高通量測(cè)序 鎖定病原體“命門”

病原體能使人類群體性致病甚至致死，為追本溯源，找到變異基因作為有效靶點(diǎn)，科學(xué)家們?cè)谟瓚?zhàn)埃博拉病毒的過(guò)程中取得突破。

《科學(xué)》雜志的歷史上，刊載過(guò)一篇沉重的學(xué)術(shù)文章。2014年一篇關(guān)于通過(guò)基因組學(xué)手段監(jiān)測(cè)埃博拉病毒的起源和傳播的論文，在刊登時(shí)已有6名研究人員因感染埃博拉而死亡。

“對(duì)埃博拉病毒的研究和控制是高通量測(cè)序技術(shù)(二代測(cè)序技術(shù))全面應(yīng)用的首次‘實(shí)戰(zhàn)’。”日前，在由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院主辦的第二屆感染性疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)高峰論壇上，參加過(guò)與埃博拉病毒一線作戰(zhàn)的研究人員，對(duì)中國(guó)團(tuán)隊(duì)與埃博拉病毒“作戰(zhàn)”的戰(zhàn)略戰(zhàn)術(shù)進(jìn)行了揭秘。中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所研究員劉翟表示，病原體能使人類群體性致病甚至致死，二代測(cè)序技術(shù)及宏基因組學(xué)能幫助人類追溯病原體、捕捉放大它們?cè)诜肿铀缴系淖兓?、鎖定病原體“命門”，最終贏得“人毒之戰(zhàn)”“人菌之戰(zhàn)”。

測(cè)準(zhǔn)遺傳物質(zhì) 新策略抓住病毒“七寸”

在2014西非埃博拉病毒爆發(fā)期間，美國(guó)的團(tuán)隊(duì)最初斷言病毒可能在加速進(jìn)化。劉翟回憶，這一發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時(shí)是一個(gè)“面臨強(qiáng)敵”的信號(hào)，它意味著傳統(tǒng)的檢測(cè)防治方法或許失效，如果埃博拉病毒是迅速變化且致命性疊加的致病原，其危險(xiǎn)性將比人類最初認(rèn)知的更高。

“病毒在短時(shí)間內(nèi)迅速變化并不符合進(jìn)化邏輯。”劉翟說(shuō)，要改變美國(guó)團(tuán)隊(duì)的結(jié)論，中國(guó)團(tuán)隊(duì)需要提供更多的事實(shí)和數(shù)據(jù)。

中國(guó)團(tuán)隊(duì)在非期間檢測(cè)了大量臨床樣本，對(duì)175株埃博拉病毒進(jìn)行了全基因組測(cè)序。“利用二代測(cè)序技術(shù)，很少的變異也能被‘覺(jué)察’到。”劉翟說(shuō)。

二代測(cè)序的應(yīng)用不是簡(jiǎn)單地將病例樣本中的基因提取出來(lái)進(jìn)行比對(duì)。全基因組的遺傳信息繁雜而海量，測(cè)定不只包括量的疊加，還包括相互作用和影響，即測(cè)定病毒在宿主體內(nèi)的進(jìn)化，以體現(xiàn)宿主和病毒的基因組之間的相互作用與關(guān)聯(lián)。宏基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)是人和病毒的遺傳物質(zhì)混在“一個(gè)籃子里”，這增加了研究工作難度;此外，由于埃博拉病毒是RNA病毒，共同提取的將是人類遺傳物質(zhì)中的RNA，RNA的復(fù)雜程度也加大了研究難度……

為此，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)了埃博拉病毒基因組的新測(cè)序策略——擴(kuò)增子深度測(cè)序技術(shù)，并開發(fā)了一套全新的生物信息學(xué)分析流程。“我們?cè)O(shè)計(jì)了標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行方法驗(yàn)證，將測(cè)序方法的假陽(yáng)性率控制在千分之一以下。”劉翟介紹，考慮到在宿主中病毒的痕量，團(tuán)隊(duì)還在方法的敏感性上取得了突破，做到低濃度樣本下仍能探測(cè)到位點(diǎn)變化。

團(tuán)隊(duì)對(duì)于樣本的生物信息學(xué)分析，在病毒暴發(fā)過(guò)程中第一次鎖定了埃博拉病毒的“進(jìn)攻線路圖”。劉翟展示的病毒地理學(xué)聯(lián)絡(luò)圖，顯示與西非的城市熱度和交通樞紐相一致。

除了進(jìn)攻路線，團(tuán)隊(duì)還揭示了埃博拉病毒基于自身的“戰(zhàn)術(shù)變化”——在宿主內(nèi)，埃博拉病毒曾經(jīng)產(chǎn)生了710個(gè)單核苷酸變異位點(diǎn)，也維持著最保守基因的不變。保守基因的發(fā)現(xiàn)相當(dāng)于抓到了病毒的“七寸”。劉翟逆向思維，“最保守基因的突變對(duì)于病毒大都有害，可以作為最有效的抗病毒靶點(diǎn)。”

預(yù)判威脅 防患SARS“東山再起”

同類技術(shù)在SARS(嚴(yán)重急性呼吸綜合征)同族病毒的發(fā)現(xiàn)與監(jiān)控中，也發(fā)揮了居功至偉的作用。

幾年前，廣東省四個(gè)豬場(chǎng)出現(xiàn)了小豬仔急性腹瀉死亡的疫情，兩萬(wàn)多頭小豬出生后6天之內(nèi)迅速死亡。這引起了軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究員童貽剛的注意，“近年來(lái)發(fā)生的重大傳染病疫情大部分由動(dòng)物病毒跨種傳播引起，此次疫情發(fā)生地距離SARS發(fā)源地小于100公里。我們通過(guò)遺傳物質(zhì)的測(cè)序確定致病病毒也是一類冠狀病毒。”病毒類型、發(fā)生地點(diǎn)以及近年規(guī)律都不同程度地亮起“警報(bào)”。

《變形金剛》里的威震天被消滅多次，卻會(huì)在宇宙的盡頭休整，一旦人們放松就伺機(jī)重生。SARS冠狀病毒在2003年造成了全球性的恐慌之后，會(huì)不會(huì)上演威震天的戲碼?

為了回答新發(fā)現(xiàn)病毒與SARS病毒同源性如何、如何傳播、感染人類能力等問(wèn)題，多個(gè)科研機(jī)構(gòu)組成的團(tuán)隊(duì)共同展開研究，基于二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行病毒分離鑒定、動(dòng)物感染回歸實(shí)驗(yàn)、回顧性檢測(cè)等工作。團(tuán)隊(duì)將新病毒命名為豬急性腹瀉綜合征(SADS)冠狀病毒。

“通過(guò)新舊病毒的比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)它與SARS病毒在外殼蛋白上有86%的相似度。”童貽剛說(shuō)，這說(shuō)明感染蛋白可能發(fā)生了變化。也就是說(shuō)，病毒獲準(zhǔn)進(jìn)入機(jī)體完成感染的“敲門磚”變了。

隨后，科研團(tuán)隊(duì)用已確定的病毒特征為“釣餌”，在廣東地區(qū)近幾年收集的蝙蝠標(biāo)本中，尋找是否有蝙蝠攜帶關(guān)聯(lián)病毒。在幾百個(gè)樣本中，團(tuán)隊(duì)獲得了58份結(jié)果為陽(yáng)性的樣本，大部分來(lái)自中華菊頭蝠(注：科學(xué)家們此前證實(shí)SARS病毒正是來(lái)源于中華菊頭蝠)。團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了病毒傳播路線圖的繪制，發(fā)現(xiàn)發(fā)病的4個(gè)豬場(chǎng)并沒(méi)有相互傳染，很有可能是通過(guò)蝙蝠的糞便傳播。

“我們對(duì)豬場(chǎng)的飼養(yǎng)員進(jìn)行了病原體檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)人員感染。”童貽剛說(shuō)，但是對(duì)于病毒組學(xué)的研究表明，該類病毒是有能力感染人類的。病毒對(duì)人體的作用，以及激發(fā)人體內(nèi)的免疫反應(yīng)和對(duì)病毒表達(dá)的調(diào)控，仍是一個(gè)嚴(yán)峻課題，有待探索。

初入臨床 顛覆對(duì)罕見(jiàn)菌致病性認(rèn)識(shí)

除了在威脅全球的重大傳染病疫情的防控中發(fā)揮重要作用，二代測(cè)序技術(shù)在日常臨床中的應(yīng)用將有助于“認(rèn)新”“控藥”“測(cè)毒”等，即診斷新型病原體、確定病毒的抗藥性以防止抗生素濫用、測(cè)定不同流行病的源頭等。

“近一年僅我們團(tuán)隊(duì)在診斷病歷中就發(fā)現(xiàn)8例諾卡氏菌病例。而在教科書中，這類菌被描述為罕見(jiàn)菌。”復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科主任胡必杰教授說(shuō)，過(guò)往資料表明，人類對(duì)這種菌的致病性認(rèn)識(shí)非常有限。

胡必杰認(rèn)為，現(xiàn)實(shí)與教科書中的反差是由于此前的手段難以幫助醫(yī)生診斷出這種致病菌。“它非常細(xì)小，在同樣的培養(yǎng)條件下，很難被分離出來(lái)，而且需要7天才會(huì)培養(yǎng)到可見(jiàn)。普通培養(yǎng)一般3天。”胡必杰說(shuō)，菌體的“個(gè)性”使得憑經(jīng)驗(yàn)在病例中發(fā)現(xiàn)它相對(duì)困難。

二代測(cè)序技術(shù)讓它們重新回到醫(yī)生的診斷“視野”。胡必杰表示，通過(guò)對(duì)宏基因組進(jìn)行測(cè)序，可無(wú)差別地檢測(cè)各種病原體，突破了傳統(tǒng)檢測(cè)手段的限制，大大提高了病原學(xué)檢出的敏感性，這種之前難以被檢出的病原體也“露了餡”。24小時(shí)內(nèi)診斷也能為急性感染的判斷和對(duì)癥迅速給出參考。

由于設(shè)備要求高、技術(shù)門檻高、平臺(tái)構(gòu)建需要大量資金投入，目前在臨床應(yīng)用領(lǐng)域，二代測(cè)序只是“初入”，只有條件好、資金充足的少量三甲醫(yī)院在建相關(guān)平臺(tái)、培養(yǎng)和儲(chǔ)備技術(shù)人員。此外，不同樣本的提取如何才能高效準(zhǔn)確、遺傳物質(zhì)的提取質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如何，都尚待完善。中國(guó)食品藥品檢定研究院的雙盲測(cè)試表明，對(duì)于同樣的已知基因，不同測(cè)序公司的結(jié)果也并非完全一致。

中國(guó)工程院副院長(zhǎng)、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院院校長(zhǎng)王辰院士呼吁：感染性(傳染性)疾病危害嚴(yán)重，精準(zhǔn)診斷是實(shí)現(xiàn)其精準(zhǔn)防控的前提。針對(duì)感染這一重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題，需要將基因檢測(cè)與傳統(tǒng)檢測(cè)相結(jié)合，加快將最新的生物科技轉(zhuǎn)化成先進(jìn)生產(chǎn)力，應(yīng)用于臨床感染精準(zhǔn)診療。(記者 張佳星)

關(guān)鍵詞： 通量 命門 威震